Premio Nobel de Química 2014

El pasado Miércoles, 8 de Octubre de 2014, fue entregado el Premio Nobel de Química. Los ganadores este año han sido los americanos Eric Betzig y William Moerner, y el alemán Stefan Hell. En palabras de la Academia de Ciencias de Suecia, los méritos por los que se les ha premiado son: “por el desarrollo de la microscopía de fluorescencia de alta resolución”.

W. E. Moerner

Erich Beltzig

Stefan. W. Hell

Durante siglos, uno de los mayores intereses de los científicos ha sido poder observar con sus propios ojos aquello que por su tamaño tan reducido es inasequible a nuestra vista. Para ello se construyeron los microscopios que, poco a poco, por la mejora de sus componentes, permitieron observar entidades tan pequeñas como células, bacterias y algunos de sus componentes. Pero toda esta mejora técnica se encontraba con una limitación imposible de soslayar por mucho que se mejorasen las lentes que forman el microscopio. La resolución máxima que se puede alcanzar con un microscopio convencional viene impuesta por la ley de Abbe. Según esta ley, la resolución depende de la longitud de onda de la radiación que se use para iluminar la muestra, del índice de refracción de esta muestra y de la semiabertura del objetivo. De este modo, aproximadamente la resolución suele ser, como mucho, la mitad de la longitud de onda de la radiación. Debido a que los organismos vivos como células y bacterias no soportan la energía de radiaciones con longitud de onda por debajo de 400 nm, la resolución que se puede alcanzar con los microscopios clásicos se limita a 200 nm. Por debajo de este tamaño es imposible ver la estructura de la materia con estos microscopios.

Para superar esta limitación, los galardonados desarollaron la microscopía STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy). Se trata de una técnica microscópica basada en la fluorescencia de sondas luminiscentes que se introducen en el objeto que se quiera visualizar. Estas sondas son compuestos químicos capaces de emitir luz (fluorescencia) mientras son excitados con radiación de longitud de onda adecuada para que se produzca un tránsito electrónico. Para producir esta excitación se emplea la radiación procedente de un láser (que se denominará a partir de ahora como de excitación). Como los compuestos fluorescentes sólo emiten luz mientras se excitan, la zona que emitiría luz en el objeto sería aquella sección iluminada por el láser. Sin embargo, si se emplease sólo este procedimiento no se habría introducido ninguna mejora respecto a los límites de resolución marcados por la ley de Abbe. Para introducir una mejora, se emplea un segundo láser (denominado de extinción) con una longitud de onda mayor que el láser de excitación. La función de este segundo láser es “apagar” la luz que se emite en el contorno de la sección iluminada por el láser de excitación (Figura 1). De esta manera se reduce la porción del objeto que se vería por la emisión debida a la sonda fluorescente.

Figura 1. Esquema de los láseres empleados en microscopía STED.

Lo que resulta especialmente importante es que con este modo de trabajar, en la ley de Abbe se introducen nuevas variables como la intensidad del láser de extinción y de la intensidad de saturación de la sonda fluorescente. De este modo, por medio del uso de láseres más intensos y la síntesis de compuestos fluorescentes con una saturación adecuada se pueden reducir sensiblemente los límites de resolución que hasta entonces había estado fijados en los 200 nm, pudiéndose abordar la visualización de estructuras y eventos hasta entonces imposibles de observar.

Para terminar debe explicarse de qué modo se puede llegar a extinguir la radiación emitida por la sonda fluorescente. En la Figura 2 se muestran dos niveles electrónicos hipotéticos. El de más baja energía es el llamado nivel fundamental y el de más alta energía es un nivel excitado. Puede verse que en el nivel fundamental se han dibujado unas líneas más finas y próximas entre sí que representan a niveles vibracionales. Cuando un electrón es excitado al nivel de energía superior puede retornar al nivel fundamental emitiendo un fotón de dos maneras: de forma espontánea o de forma estimulada (Figura 3). 

Figura 2. Niveles fundamental y excitado hipotéticos para una sonda fluorescente.

Figura 3. Emisión espontánea (Izquierda) y emisión estimulada (Derecha).

Para estimular la relajación del electrón es precisa la presencia de un fotón con la energía correspondiente al tránsito entre el nivel electrónico de partida y el de llegada al que se quiere llegar. Aquí es donde entra en juego el láser de extinción, que aporta los fotones necesarios para que se estimule la relajación del electrón excitado a uno de los niveles vibracionales más elevados del nivel fundamental. De este modo, en la zona iluminada sólo por el láser de excitación se tiene una emisión espontánea (fluorescencia), mientras que en el contorno iluminado por el láser de extinción se tiene una emisión estimulada (con emisión de fotones de menor energía que los emitidos en la zona descrita anteriormente). Para que solamente se vea la zona que nos interesa basta con poner un filtro que deje pasar la radiación de la fluorescencia, mientras que no se deje pasar a los fotones menos energéticos procedentes de la emisión estimulada.